La levadura es un microorganismo unicelular, generalmente de la familia Saccharomyces cerevisiae, utilizado en enología para la fermentación alcohólica. Este proceso convierte los azúcares presentes en el mosto de uva en alcohol y dióxido de carbono, desempeñando un papel esencial en la elaboración del vino. También se utilizan levaduras no Saccharomyces, que contribuyen a la complejidad aromática del vino o a su bioprotección. La levadura es uno de los microorganismos más utilizados en la industria, abarcando un gran número de sectores comerciales, con una elevada implicación en la sociedad actual.
La Levadura Seca Activa (LSA) en la Vinificación
Los cultivos iniciadores de levadura se comercializan generalmente en forma deshidratada, como Levadura Seca Activa (LSA), lo cual da lugar a un producto estable. Estas levaduras son productos obtenidos por deshidratación parcial de cultivos de levaduras a nivel industrial que previamente han sufrido un proceso de selección clonal. Esto supone la existencia de un amplio catálogo de levaduras para cada empresa. Estos polvos de aspecto gris amarillento más o menos granuloso con un índice de humedad que no sobrepasa el 6-8%, contienen según las preparaciones 10 a 60% de levaduras vivas inmediatamente regenerables, es decir, 1 a 16.000 millones por gramo. La levadura seca activa ofrece un alto nivel de consistencia, garantizando una fermentación estable y predecible, además de asegurar que el producto final mantenga un sabor y aroma uniformes. Es fácil de almacenar y de usar en la elaboración del vino.
Proceso de Producción de Levadura Seca Activa
La producción de levadura seca activa comienza con el cultivo de una cepa pura de levadura en laboratorio. Una vez establecido el cultivo puro, se trabaja bajo condiciones estrictamente asépticas para evitar cualquier riesgo de contaminación. Posteriormente, se multiplica en recipientes y tanques cada vez mayores con una fórmula específica que incluye agua, melaza, sales, oligoelementos y vitaminas, bajo control de pH. La crema de levadura se seca mediante filtración y atomización. Las células de levadura se suspenden en una corriente de aire caliente, que elimina el agua sin dañar los microorganismos y deja una levadura seca y pulverulenta, fácil de envasar y almacenar. El resultado final es una levadura altamente concentrada que puede rehidratarse en agua antes de su uso. La forma de fideo o vermicelli se obtiene durante los procesos de fabricación como el secado por atomización o la aglomeración, que generan partículas alargadas.
Control de Calidad y Comercialización
Antes de su comercialización, las levaduras vínicas se someten a pruebas de pureza, viabilidad y rendimiento para cumplir las especificaciones requeridas. Esto incluye controles según los estándares de la industria del vino, detección de contaminantes y verificación del comportamiento fermentativo, garantizando la trazabilidad completa y productos de alta calidad.
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Diversidad y Selección de Cepas de Levadura
Existen aproximadamente 60 géneros diferentes de levadura, los cuales se componen de unas 500 especies diferentes. Entre estas, Saccharomyces cerevisiae es sin duda, la más utilizada en alimentos y pienso. Dentro de la especie, hay miles de cepas diferentes, cada una con una composición genética única, que da lugar a resultados diferentes en términos de metabolismo y actividad biológica. La genética no es el único factor: las propiedades de la pared celular de la levadura también dependen tanto de la cepa de la levadura como de los procesos de producción utilizados. Saccharomyces cerevisiae presenta características variables según las condiciones de selección y producción en fábrica (resistencias, actividades enzimáticas, composición química), lo que permite diferentes aplicaciones en la vinificación.
Aislamiento y Recolección de Cepas
Las cepas de levadura se encuentran de forma natural en las uvas, en la bodega o en el entorno. Se emplean diversas pruebas y métodos de laboratorio para recolectarlas y aislarlas. Por definición, todas las levaduras son híbridas, al igual que los seres humanos. Sin embargo, es posible reproducir en laboratorio las condiciones naturales que provocan la hibridación. Este proceso tiene lugar cuando dos cepas de levadura interactúan y se reproducen, dando lugar a una nueva cepa que combina las características de ambas progenitoras. Las cepas de levadura se cultivan en medios de esporulación. Luego se permite que las cepas puras interactúen y se reproduzcan mediante un proceso conocido como apareamiento, que puede realizarse combinando las dos cepas. También puede realizarse un apareamiento masivo, esporulando múltiples levaduras y mezclando sus esporas. Sea cual sea la técnica empleada, las cepas híbridas resultantes pasan por el mismo proceso que una levadura seleccionada: se identifican, se caracterizan, se prueban en fermentación y se verifican para garantizar su correcto funcionamiento y su capacidad para ser producidas y conservadas como cultivos puros en laboratorio.
Cepa Saccharomyces cerevisiae y sus Variedades
Las levaduras Fermivin son principalmente cepas seleccionadas de Saccharomyces cerevisiae var. cerevisiae y var. 1. Taxonómicamente, las levaduras que se añaden a la harina para que «suba», al maltear para que dé cerveza y las que convierten el mosto en vino, pertenecen a una misma especie, Saccharomyces cerevisiae. Asimismo, las levaduras que se añaden juntamente con el azúcar al vino para dar cava y las que forman el velo que origina el jerez y vinos similares son de la misma especie. Lo que ahora conocemos como género Saccharomyces ha sido subdividido y reagrupado en diversas ocasiones desde que se definió en 1870. Hoy en día, se considera que este género tiene 10 especies, la más importante de las cuales es precisamente S. cerevisiae. A pesar de ello, dentro de esta especie existe una gran diversidad, que obliga a subdividirla en seis grupos, sin valor taxonómico, aunque con relevancia práctica. Estos grupos (llamados cerevisiae, ellipsoideus, oviformis, cheresanus, diastaticus y logos) más o menos coinciden con los diferentes usos de estas variedades. A lo largo de los años se han seleccionado multitud de cepas de S. cerevisiae de diversa procedencia geográfica que combinan un buen desempeño fermentativo con un correcto perfil organoléptico, pero existe cierto grado de variación respecto a parámetros fermentativos como adaptación a temperaturas extremas, velocidad de fermentación, requerimientos de nitrógeno, etc. Por lo tanto, el enólogo dispone de una paleta de cepas a elegir en cada condición, pero no existe la cepa ideal para todos los mostos y tipos de vino, ya que las que tienen buena tolerancia a estrés o bajos requerimientos nutricionales pueden no ser las que aporten más aromas, de manera que hay muchas cepas de levadura potencialmente mejorables en uno o varios aspectos.
Identificación y Caracterización de Cepas de Levadura
El mayor reto al identificar cepas de levadura recae en la necesidad de diferenciar grupos y especies que taxonómicamente están muy cerca, pero que tienen propiedades muy diferentes en lo que respecta a sus aptitudes fermentativas y organolépticas. Además, durante las primeras fases de la fermentación aparecen en el mosto levaduras de los géneros Kloeckera, Candida, Rhodotorula, Pichia, Kluyveromyces o Hansenula, entre otros. La presencia de estas especies puede dar lugar a metabolitos secundarios que modifiquen las propiedades organolépticas del producto final, y, por tanto, es importante disponer de buenos métodos de detección para su control.
Métodos de Identificación Molecular
El sistema más fiable de clasificar las levaduras se basa en comparaciones directas de las composiciones de los DNA de la cepa problema con una cepa patrón, por hibridación. Se considera que dos variedades pertenecen a la misma especie cuando sus DNA difieren en menos del 20%. Otro sistema para diferenciar entre géneros y especies distintas dentro de las levaduras del vino es el análisis de los polimorfismos en el DNA ribosomal. Las ITS (secuencias internas transcritas) son zonas muy poco conservadas que se utilizan para diferenciar entre especies de Saccharomyces y entre diferentes géneros de levaduras.
Análisis del Cariotipo
El cariotipo de una cepa de levadura, que representa la disposición de sus cromosomas, permite distinguir entre diferentes especies del género Saccharomyces y entre éste y otros géneros. Este método permite reconocer el grado de parentesco entre cepas procedentes de diferentes instalaciones, independientemente de su morfología o de su comportamiento metabólico. Sin embargo, el análisis cariotípico por campo pulsante es caro, complicado y lento, difícil de adaptar a las necesidades cotidianas de una bodega.
Análisis del DNA Mitocondrial (mtDNA)
La técnica posiblemente más sencilla y eficaz para distinguir diferentes cepas de levadura no se basa en el análisis del DNA cromosómico, sino del DNA mitocondrial (mtDNA). La mitocondria contiene una molécula de DNA circular, que en la levadura tiene unos 75 kb. Esta molécula presenta una gran variabilidad de secuencia, lo que la convierte en un instrumento valioso para la identificación de cepas de levadura. Además, y debido a la diferente composición en pares de bases entre el mtDNA y el DNA genómico, es posible hacer digestiones enzimáticas que corten completamente este último, a pesar de producir bandas de medidas discretas provenientes exclusivamente del mtDNA (RFLP de mtDNA).
Otras Técnicas de Identificación
Existen otras técnicas de identificación de cepas de levaduras, que o bien no se utilizan tanto como las anteriores, o todavía resultan muy complicadas para su utilización sistemática. El análisis de las proteínas de la levadura es un método mucho más sencillo que los métodos de identificación basados en la extracción del DNA, aunque mucho menos sensible a variaciones genéticas entre cepas de levadura relativamente próximas. El cromatógrafo de gases se ha convertido en un instrumento relativamente habitual en los laboratorios de enología. La técnica PAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), o DNA polimórfico de amplificación aleatoria, es una técnica de análisis del DNA genómico por medio de PCR usando cebadores aleatorios. A partir de los genes de los rRNA y del mitocondrial, el genoma de levadura tiene una serie de secuencias variables de DNA (los loci ADH, MAL i SUC, las secuencias delta, o los elementos Ty o Y’ entre otros) que presentan cambios entre diferentes cepas, ya sea dentro de la propia secuencia, ya sea por su posición en el genoma.
Factores que Afectan la Fermentación y la Elección de Cepas
Existen muchas causas que históricamente se han atribuido a las fermentaciones lentas o a las paradas de fermentación. Estas incluyen factores vitícolas y del viñedo (altos grados Brix de la cosecha, deficiencias nutricionales, degradación fúngica y residuos agrícolas, incluidos pesticidas, fungicidas y herbicidas), de gestión de la bodega (elección de la cepa de levadura no adecuada, procedimientos de rehidratación incorrectos, temperaturas de fermentación no óptimas, clarificación excesiva del mosto y niveles de nitrógeno asimilable por la levadura no correctos [NFA]), de sustancias inhibidoras (etanol, ácido acético, ácidos grasos de cadena media y sulfitos) y factores físicos (pH y temperaturas extremas).
La Proporción Glucosa:Fructosa
A medida que investigadores y productores de levaduras han ido avanzando en la comprensión de los mecanismos de fermentación, algunos de los problemas mencionados anteriormente se han ido resolviendo. Sin embargo, la menor influencia de los factores mencionados ha visto el aumento en concomitancia de la influencia de un factor diferente y que actualmente representa la causa predominante de las fermentaciones lentas y paradas: la proporción entre glucosa y fructosa. Hay evidencias que sugieren que en más del 90 por ciento de los casos, cuando tienen lugar fermentaciones lentas o paradas, la relación glucosa:fructosa es inferior a 1,0.
Preferencia por Glucosa en Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae es en general una levadura glucófila, lo que significa que consume preferentemente glucosa en lugar de otros azúcares. En la mayoría de los casos, durante las fermentaciones la glucosa se consume a un ritmo mayor que la fructosa (el otro azúcar predominante en las fermentaciones enológicas). Como consecuencia, la proporción de fructosa aumenta a medida que avanza la fermentación. Cuando al final de la fermentación la fructosa se convierte en el azúcar predominante, a menudo esto da lugar a fermentaciones lentas o paradas. Sin embargo, es importante reconocer que las cepas de levadura Saccharomyces cerevisiae (las más utilizadas en las vinificaciones) consumen determinados azúcares a niveles diferentes. Algunas son glucófilas, otras fructofílicas y entre medias hay una variabilidad continua.
Implicaciones de la Fructosa Residual
La fructosa es aproximadamente el doble de dulce que la glucosa, por lo que cualquier fructosa que no se consuma puede afectar negativamente a la calidad del vino debido a que los vinos pueden percibirse más dulces de lo que realmente son. Además, la fructosa residual también significa un menor rendimiento de etanol y un mayor riesgo de deterioro microbiano. Estas consecuencias se pueden mitigar un poco mediante el uso de cepas de levadura fructofílicas, es decir, cepas que tienen una mayor capacidad para consumir fructosa. La capacidad de ciertas cepas de levadura para consumir preferentemente un determinado tipo de azúcar no es nueva, aunque la selectividad exhibida por cualquier levadura en particular no es constante y depende de las condiciones de cultivo a las que ha estado sometida durante el crecimiento.
Manejo de la Fermentación en Condiciones de Estrés
El rendimiento de la levadura está determinado en parte por el genotipo o composición genética, que depende de la especie y la cepa. Las cepas de levaduras enológicas difieren a nivel de cinética fermentativa, requisitos de nitrógeno, tolerancia al etanol, tolerancia a la temperatura y también consumo de glucosa:fructosa (por nombrar solo algunas de las características que más las definen). Estas diferencias entre cepas son más pronunciadas en condiciones estresantes, lo que sugiere diferencias a nivel de adaptación al medio ambiente. Con respecto al consumo de glucosa y fructosa, la suplementación con nitrógeno ayuda a estimular de forma importante la utilización de fructosa y, en condiciones de alto contenido de etanol, la utilización de fructosa se inhibe más que la utilización de glucosa. Por lo tanto, el uso de una cepa de levadura fructofílica por sí sola no garantizará necesariamente una fermentación sin problemas.
Para reducir aún más la probabilidad de una fermentación lenta o parada como consecuencia del desequilibrio en la relación glucosa:fructosa, se deben tener en cuenta las diferencias entre las variedades de uva (es más probable que haya problemas con Chardonnay que con Chenin Blanc, por ejemplo). También hay que tener en cuenta la vendimia. En añadas cálidas y secas, generalmente hay una relación glucosa:fructosa más baja. La selección de la cepa de levadura debe, en parte, basarse en la composición de los azúcares en el mosto. Se recomienda el uso de una cepa de levadura fructofílica cuando hay una mayor cantidad de fructosa que de glucosa, es decir, cuando la relación glucosa:fructosa es inferior a 1,0. Finalmente, cuando hay más fructosa que glucosa, es crucial prestar atención a otros factores de riesgo adicionales, como NFA insuficiente y alto potencial de alcohol final.
Mejora Genética de Cepas de Levadura para la Vinificación
La presente invención se refiere a un método de obtención de cepas de levaduras no modificadas genéticamente con propiedades vinícolas optimizadas, así como a dichas cepas. La presente invención divulga un método de obtención de cepas mejoradas de Saccharomyces cerevisiae con propiedades vinícolas optimizadas que comprende preparar al menos un cultivo donde estén en contacto una cepa inicial de S. cerevisiae con al menos 10 mg/l de 2-aminoetil-L-cisteína en medio de cultivo, se crece durante al menos 5 semanas y aislar mutantes individuales de la cepa de S. cerevisiae.
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Optimización de Propiedades Organolépticas
Desde un punto de vista enológico, la utilización de cepas de levaduras superproductoras de aminoácidos para la fermentación de los vinos daría como resultado vinos más aromáticos, ya que muchos aminoácidos son catabolizados a alcoholes superiores muy apreciados por esta industria contribuyendo al aroma del vino. La treonina es un aminoácido esencial, cuyo catabolismo genera compuestos aromáticos con un alto interés biotecnológico. Uno de los metabolitos más importantes derivados de la treonina es el sotolón. Los mutantes resistentes a HNV (hidroxinorvalina, un análogo tóxico de treonina) tienen alterada la regulación por retroalimentación y acumulan treonina diluyendo así la concentración del tóxico en el interior de la célula. Se han obtenido derivados superproductores de treonina a partir de una cepa vínica utilizada como pie de cuba para la fermentación y de varias cepas de levadura panadera. Los derivados de la cepa vínica fermentativa superproductores de treonina producían un mosto con mayor contenido en treonina, que tras crianza biológica, se obtenía un vino con mayores niveles de sotolón.
Influencia en la Composición del Vino
El grueso del metabolismo de los azúcares presentes en el mosto se dedica a la producción de etanol mediante fermentación, de manera que el piruvato producido por la glicólisis no es respirado vía mitocondria, sino que es descarboxilado a CO2 y acetaldehído, que es utilizado para reoxidar los equivalentes reducidos, produciendo etanol, y con una producción baja de biomasa de levadura. Sólo cuando los niveles de azúcares son muy bajos se activa la respiración, produciendo mucha más biomasa y energía en forma de ATP por mol de glucosa consumida. Parte del NADH en fermentación es desviado para la producción de glicerol, un polialcohol esencial para la tolerancia al estrés hiperosmótico, y que aporta al vino cuerpo y dulzor característicos, constituyendo el tercer componente en peso del vino, tras el agua y el etanol. Parte del acetaldehído puede ser desviado en la producción de ácido acético, que por el contrario es un producto no deseado ya que contribuye a la acidez volátil, y da un carácter avinagrado al vino en cuanto se traspasa un umbral. Así pues, el metabolismo de los hidratos de carbono, y el equilibrio entre fermentación y respiración son esenciales para la producción de vino con un correcto equilibrio organoléptico.
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