La investigación del equipo de José E. Pérez Ortín, adscrito al Instituto de Biotecnología y Biomedicina (Biotecmed) de la Universitat de València y al Instituto de Biología Integrativa de Sistemas (I2SysBio, UV/CSIC), se centra en comprender cómo las células responden a las señales que reciben, modificando su expresión génica. Utilizan principalmente como organismo modelo la levadura Saccharomyces cerevisiae, considerada el eucariota mejor conocido y un modelo ideal para la comprensión a nivel celular de procesos moleculares conservados evolutivamente.
El control de la expresión génica es un proceso multinivel que afecta a todas las etapas de la transcripción, desde la iniciación hasta la estabilidad de los ARNm. La complejidad de este fenómeno requiere nuevas aproximaciones, incluyendo las de escala genómica, un enfoque que solo puede realizarse en un organismo modelo como la levadura S. cerevisiae, que cuenta con las herramientas necesarias.
El grupo de Pérez Ortín desarrolla herramientas genómicas en levadura para estudiar la transcripción in vivo y clarificar las redes funcionales que controlan los genes y la transcripción a escala global. El objetivo de esta línea de investigación es definir los mecanismos que regulan la expresión génica durante la elongación transcripcional y la relación entre los mecanismos de control de la transcripción y la degradación de mensajeros para el control homeostático de sus niveles.
La proteína eIF5A: un factor esencial en la regulación de la traducción
Uno de los factores clave en el control de la expresión génica estudiados por el equipo es la proteína eIF5A, altamente conservada desde levaduras hasta humanos y esencial en las células eucariotas. El interés principal es entender el mecanismo de regulación de la traducción por eIF5A, determinando cuáles son las proteínas cuya síntesis requiere de este factor y cómo, directa o indirectamente a través de sus dianas, eIF5A actúa en procesos patológicos como la fibrosis, el cáncer o durante el envejecimiento.
eIF5A es un factor de elongación que se une a los ribosomas cuando estos se atascan durante la síntesis de algunas proteínas que contienen motivos con prolinas, glicinas y aminoácidos cargados. El grupo ha determinado que eIF5A es necesario para la síntesis de forminas (de levadura, mosca y ratones), colágeno (de ratón y humanos) y proteínas humanas que tienen tendencia a la agregación en células envejecidas.
Su objetivo es determinar mecanísticamente la función de eIF5A, a través de la síntesis de sus proteínas diana, en patologías tales como la fibrosis, el cáncer o durante el envejecimiento. Además, se ha demostrado que el factor de elongación eIF5A es necesario para la formación de shmoos y el crecimiento polarizado en la respuesta a feromona de células de S. cerevisiae.
Evolución no darwiniana en levaduras: un hallazgo sorprendente
El equipo de investigación de la Universitat de València ha descubierto que la levadura de pan es capaz de evolucionar sorteando las reglas de la selección natural. Este estudio, publicado en la revista 'PLOS One', plantea que no todos los organismos vivos evolucionan siempre por selección natural o deriva genética.
La evolución de los seres vivos ocurre mediante la selección natural de los individuos más aptos -el mecanismo propuesto por Charles Darwin-, o bien por deriva genética, implicando al azar en el proceso de selección. Estos eran los únicos mecanismos demostrados hasta ahora en los seres vivos con información genética heredable. En los sistemas físicos no vivos, como los minerales, planetas, átomos o moléculas, la evolución se produce de forma distinta, siguiendo leyes fisicoquímicas que permiten predecir el resultado del proceso evolutivo.
Los investigadores han constatado que, bajo determinadas condiciones, la levadura de panadería (Saccharomyces cerevisiae) es capaz de evolucionar desde un genoma inestable a otro estable mediante un mecanismo determinista -es decir, predecible-, que es independiente de la selección natural. José E. Pérez Ortín explica que se trata de un proceso evolutivo guiado por principios químico-físicos, formalmente similar a los mecanismos deterministas que actúan en los sistemas no biológicos, sin herencia.
Este trabajo parte de un estudio previo en el que, al analizar células de volúmenes diferentes en esta levadura, se observó que las de mayor tamaño contenían más copias del gen rDNA y se postuló que era un proceso de selección natural. Sin embargo, los resultados se mostraron contrarios a dicha deducción, ya que las células con mayor número de copias no eran más aptas que el resto, lo que llevó al equipo a buscar un nuevo mecanismo.
Partiendo de los estudios del grupo de Kobayashi de la Universidad de Tokio, donde se propone que el mecanismo para el gen rDNA en levadura ocurre por 'solo amplificación' y, por tanto, el número de copias de un gen únicamente puede crecer en la población de células, se realizaron simulaciones de ordenador del proceso observado. El modelo bioinformático explica perfectamente los resultados observados: la población va aumentando gradualmente el número de copias del gen, pero el proceso no deriva en producción de células más aptas.
Técnicas básicas de Microbiología: Apariencia de Saccharomyces cerevisiae en cultivo puro
Aunque hoy por hoy se trata de un caso excepcional a la ley darwiniana de la selección natural, el estudio demuestra que pueden existir procesos independientes de ella en los seres vivos. Este hallazgo abre una vía más en el estudio de la herencia genética y augura su utilidad en el campo de los organismos de interés biotecnológico.
Desarrollo de herramientas genómicas en levadura
El Dr. José E. Pérez Ortín, en el Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universitat de València (UVEG), comenzó su investigación sobre la biología molecular de levaduras en 1992. A partir de 1995, el trabajo se orientó hacia la genómica de levaduras, participando en proyectos de secuenciación del genoma y de análisis funcional de Saccharomyces cerevisiae.
Para abordar la complejidad de la regulación de la expresión génica, el grupo de Pérez Ortín desarrolla herramientas genómicas en levadura para estudiar la transcripción in vivo y clarificar las redes funcionales que controlan los genes y la transcripción a escala global. Este enfoque de escala genómica es crucial para comprender la importancia relativa de la síntesis y la degradación de ARNm en diferentes situaciones de estrés de importancia práctica en biomedicina o biotecnología, como la respuesta al estrés osmótico, la respuesta de las cepas vínicas de S. cerevisiae a la deficiencia de nitrógeno en los mostos o la respuesta de C.
En los últimos años se ha demostrado que la regulación post-transcripcional ocurre en paralelo a la regulación de la transcripción en respuesta a muchas señales extracelulares y, en muchos casos, especialmente en mamíferos, los mecanismos post-transcripcionales son los que tienen un mayor peso en las respuestas adaptativas. Así, para la regulación de la cantidad de ARNm en la célula se recurre a la variación de la eficiencia de splicing del pre-ARNm y de la tasa de degradación de los ARNm maduros, lo que sumado a la regulación de sus tasas de traducción permite modificar rápidamente los niveles de proteínas en la célula para generar una respuesta adecuada a cada estímulo. El objetivo de esta línea de investigación es descubrir los mecanismos implicados en la regulación postraduccional de los ARNm de S. cerevisiae.
Nuevos macrochips de ADN para el genoma de Saccharomyces cerevisiae
La levadura Saccharomyces cerevisiae ha sido ampliamente utilizada para la implementación de tecnologías de chips de ADN. El grupo de Pérez Ortín, junto con otros tres laboratorios españoles de biología molecular de levaduras, ha desarrollado un lote completo de sondas del genoma de S. cerevisiae para fabricar un nuevo tipo de macrochips sobre superficie de nailon. Estos macrochips han sido evaluados y sus protocolos de uso optimizados, ofreciendo una alternativa más económica y accesible para la comunidad académica.
Los macrochips de membrana presentan varias ventajas, como su facilidad de fabricación y menor coste de uso en comparación con los microarrays de portaobjetos de vidrio. A pesar de que la densidad de las sondas en los microarrays es mayor, para organismos como la levadura, con solo 6000 genes, una alta densidad no es una necesidad crítica. Además, la etiqueta radiactiva utilizada con los macroarrays es más uniforme que la doble etiqueta fluorescente de los microarrays de vidrio.
La estrategia general para la generación de las sondas implicó la amplificación por PCR de cada ORF completo insertado en un plásmido de la colección Exclone de Research Genetics. Esta colección contiene 6080 clones, cada uno con un ORF de levadura de longitud completa diferente. Se logró amplificar el 75.5% de los clones, principalmente aquellos fragmentos de menos de 3 kbp. Para genes más largos, se empleó una segunda estrategia.
Construcción y análisis de los macrochips
Los macrochips se construyeron imprimiendo los productos de PCR directamente sobre una membrana de nailon con carga positiva. Se utilizó un robot de impresión con cabezal de 384 puntas, que generaba 6144 posiciones disponibles. Las sondas de genes se imprimieron en una sola réplica, y se incluyeron controles positivos (ADN genómico total de levadura y ADN ribosómico 18S) y negativos (ADN genómico de Escherichia coli).
Se probaron diferentes tiempos de hibridación, cantidades de muestra radiactiva y tiempos de exposición para optimizar los protocolos. Las membranas se pre-trataron con SDS para eliminar partículas y se hibridaron con la muestra radiactiva. Posteriormente, se lavaron y se expusieron a una placa de imagen para adquirir los datos.
La radioactividad se eliminó mediante un tampón de "stripping" caliente, y las membranas se almacenaron secas para futuras reutilizaciones. No se observó una disminución en el rendimiento de los macrochips durante un período de 18 meses después de la fabricación. Las imágenes se adquirieron utilizando un Phosphorimager y las intensidades de los puntos se midieron utilizando el software Array Vision.