La elaboración de productos fermentados, como el vino, ha experimentado avances significativos en el campo técnico de las fermentaciones industriales. Tradicionalmente, las vinificaciones se han realizado con inóculos de levaduras vínicas seleccionadas del género Saccharomyces. Sin embargo, estudios recientes sugieren que algunas levaduras no-Saccharomyces pueden ser utilizadas para corregir ciertos defectos del vino o para intensificar o mejorar sus propiedades organolépticas, consiguiendo así productos más originales y diferenciados.
Desafíos en el uso de levaduras no-Saccharomyces
La evaluación de la utilidad industrial de las levaduras no-Saccharomyces en la elaboración de vino se realiza normalmente mediante co-inoculación (secuencial o simultánea) con levaduras Saccharomyces en fermentaciones controladas. Sin embargo, este uso combinado de diferentes especies de levaduras conlleva el problema de que los resultados de la fermentación son imprevisibles y pueden afectar de forma indeseada a la composición química y aromática del vino.
Además, se ha descrito que en presencia de altas concentraciones de células de Saccharomyces cerevisiae se inhibe el crecimiento de otras levaduras como Torulaspora delbrueckii y Kluyveromyces thermotolerans. A pesar de esto, tanto Torulaspora delbrueckii como Kluyveromyces thermotolerans se pueden adquirir en el mercado (marcas Hansen o Lallemand) para elaborar vino, aunque su utilidad práctica en bodegas comerciales está por confirmar y aún no son levaduras vínicas de uso generalizado.
Estrategias actuales de Hansen y Lallemand
La casa Hansen vende una mezcla de levaduras, llamada MELODY.nsac, compuesta por una estirpe de Saccharomyces cerevisiae, para conseguir una fermentación alcohólica segura y fiable, y dos estirpes no-Saccharomyces (Kluyveromyces thermotolerans y Torulaspora delbrueckii) para mejorar el impacto organoléptico del aroma y la sensación en boca del vino.
Por su parte, la casa Lallemand asume que la inoculación de levaduras no-Saccharomyces en monocultivo no permite concluir la fermentación (azúcares residuales < 2 g/L) en un tiempo razonable compatible con las exigencias de las actuales técnicas de vinificación, y al mismo tiempo no garantiza la ausencia de defectos sensoriales. En consecuencia, Lallemand comercializa por separado una estirpe de Torulaspora delbrueckii y otra de Saccharomyces cerevisiae en el kit LEVEL2TM TD, y propone una inoculación del mosto secuencial, primero Torulaspora delbrueckii y 48 horas después Saccharomyces cerevisiae con la adicción de activador de fermentación para asegurar la disponibilidad de nutrientes y el correcto final de fermentación.
Ambas casas aseguran resultados positivos y fermentaciones correctas, sin embargo, con mostos de graduación probable superior a 13 ºBé la fermentación es muy lenta, comprometiendo así la calidad del vino elaborado. En las estrategias de fermentación de Hansen y Lallemand, las levaduras Torulaspora delbrueckii actúan al principio de la fermentación alcohólica en clara competencia por los nutrientes con las levaduras Saccharomyces del mosto en la inoculación secuencial (según la propuesta de Lallemand), o con las levaduras Saccharomyces silvestres del mosto más las inoculadas (según la propuesta de Hansen), y son remplazadas progresivamente por la estirpe inoculada de Saccharomyces cerevisiae que supuestamente dominará la fermentación. En ningún caso Torulaspora delbrueckii llega a ser la levadura dominante de la fermentación, debido fundamentalmente a su menor capacidad de multiplicación y a sus necesidades específicas de micronutrientes y oxígeno. La cantidad de estas levaduras no-Saccharomyces al final de la fermentación es muy pequeña, y la mayoría no son viables debido a su sensibilidad a concentraciones de alcohol superiores 10º.
Hidratación de levaduras para fermentar vinos
El problema de la acidez L-málica en el vino
Otro aspecto interesante a considerar en la elaboración de vino es la eliminación de cantidades excesivas de ácido L-málico procedentes de las uvas. Las estirpes de Saccharomyces cerevisiae casi no metabolizan el L-málico de la uva, debido a la baja afinidad por el sustrato de su enzima málico dependiente de NAD, qué además está sometido a represión catabólica; y a que carecen de un transportador activo de L-málico. El resultado es que los cambios en la acidez total del vino durante la fermentación alcohólica con Saccharomyces cerevisiae son mínimos.
Esto requiere la reducción posterior controlada del ácido málico cuando está en exceso para elaborar vinos equilibrados, particularmente con uvas de viñedos ubicados en regiones frías o en zonas cálidas con riego controlado.
Métodos de desacidificación del vino
Una opción es la desacidificación química precipitando el ácido málico mediante adición de calcio, potasio u otros cationes produciendo una sal insoluble; y otra, añadir zumo de uva o azúcar al vino para enmascarar el sabor del ácido málico. El problema es que ambas alternativas alteran las características y calidad del vino, y aún quedan cantidades residuales de ácido málico que pueden soportar el crecimiento de bacterias contaminantes a menos que se añadan dosis elevadas de sulfitos.
De forma natural, la desacidificación del vino se suele realizar biológicamente mediante fermentación maloláctica, que consiste en la conversión del ácido L-málico en ácido L-láctico y CO2 normalmente por bacterias lácticas de los géneros Leuconostoc, Lactobacillus, Pediococcus y Oenococcus. Estas bacterias se suelen encontrar en la piel de las uvas maduras o residentes en las bodegas, y también se pueden inocular en los mostos y vinos a partir de cultivos comerciales congelados o crio-desecados.
Aunque esta es la técnica más extendida en las regiones vinícolas de todo el mundo, presenta una serie de desventajas tales como que: las bacterias lácticas degradan terpenos y alteran el aroma del vino, el control de la fermentación maloláctica suele ser difícil y preocupante para el enólogo, la fermentación maloláctica puede ser incompleta, con lo que permanece el riesgo de posteriores fermentaciones en botella, y se forman aminas biógenas potencialmente perjudiciales para la salud.
Otra alternativa biológica aún en desarrollo es inocular el mosto con levaduras fermentativas capaces de degradar el ácido L-málico. Se puede utilizar Schizosaccharomyces pombe, que degrada completamente el L-málico y produce etanol mediante fermentación malo-alcohólica, o Saccharomyces malidevorans, capaz de degradar parcialmente el L-málico durante la elaboración del vino (US 4.830.968). El problema es que estas dos levaduras producen sabores desagradables y originan vinos de mala calidad.
Por otro lado, se han obtenido levaduras transgénicas Saccharomyces cerevisiae capaces de realizar simultáneamente la fermentación alcohólica y la fermentación maloláctica o la malo-alcohólica (US 5.330.774), sin embargo, su uso no está generalizado por las restricciones legales de cada país y por el rechazo de los consumidores y activistas al uso de microorganismos transgénicos en la industria alimentaria.
La levadura Torulaspora de la invención: una solución innovadora
Teniendo todo esto en cuenta, sigue existiendo en el estado de la técnica la necesidad de conseguir un procedimiento para el uso industrial de estirpes de levaduras no-Saccharomyces, que fermenten mosto de uva y soporten vivas hasta 14º de alcohol, que no requieran una inoculación secuencial con Saccharomyces cerevisiae, que sean capaces de originar la degradación de ácido málico y la producción de ácido láctico, y que sean adecuadas para elaborar, entre otros, vinos de carácter original y de excelente calidad organoléptica.
La presente invención se refiere a una levadura del género Torulaspora, caracterizada porque secreta toxinas que matan todos los tipos de levadura Saccharomyces cerevisiae, degrada ácido L-málico, produce ácido L-láctico, contiene en su interior moléculas de ARN de doble cadena (dsRNA) vírico de entre 1 y 2 Kpb, y soporta viva y activa hasta 14º de alcohol. En otro aspecto, se refiere al uso de esta levadura para la elaboración de un producto fermentado.
La levadura de la invención tiene por tanto fenotipo killer (asesino) ya que secreta toxinas activas frente a todos los tipos de levaduras Saccharomyces cerevisiae conocidas, bien sean killer de cualquiera de los tipos conocidos, o bien sensibles a las toxinas killer de cualquiera de los tipos conocidos hasta ahora, K1, K2, K28 y/o Klus (Fig. 1).
Capacidades de la levadura Torulaspora de la invención
En una realización particular, la levadura de la invención es capaz de llevar a cabo la producción de más de 0,5 g/L de ácido L-láctico y la degradación de entre 1 y 1,8 g/L de ácido L-málico. Por lo tanto, en la fermentación inoculada con la levadura de la invención, la cantidad de ácido L-láctico aumenta más de 0,5 g/L y la cantidad de ácido L-málico disminuye entre 1 y 1,8 g/L, mientras que estas cantidades permanecen prácticamente invariables en fermentaciones control sin inocular o en fermentaciones inoculadas con levaduras vínicas Saccharomyces.
La levadura de la invención, inoculada en mosto fresco, domina la fermentación del mosto hasta densidad de 1,000-1,005 g/L, permaneciendo viva hasta concentraciones de alcohol en el entorno del 14% (Fig. 2). Además, la levadura de la invención es capaz de fermentar mosto con un contenido en azúcar inferior o igual a 14 ºBé hasta menos de 5 g/L de azúcar (Fig. 2).
Asimismo, la levadura de la invención origina la degradación del ácido L-málico del mosto y la producción de ácido láctico (fermentación maloláctica) a lo largo de la fermentación alcohólica, y especialmente en las etapas finales a partir de densidad 1,005 g/L (Fig. 3 y Fig. 4). En el contexto de la presente invención un ºBé se refiere a 17 g de azúcar disueltos en 1 L de agua.
Hidratación de levaduras para fermentar vinos
Características moleculares y de identificación
La levadura de la invención contiene en su interior moléculas de ARN de doble cadena (dsRNA) vírico L (tamaño grande) y M (tamaño mediano) que permiten diferenciar distintas levaduras Torulaspora entre sí, en particular contiene moléculas de dsRNA vírico de entre 1 y 2 Kpb (Fig. 5). Además, la levadura de la invención tiene un patrón de restricción del ADN mitocondrial (con el enzima Rsa I) sin las bandas de ADN de alto peso molecular características de las levaduras S. cerevisiae (Fig. 6), lo que permite monitorizar la levadura de la invención durante la fermentación y determinar su grado de participación respecto a las levaduras S. cerevisiae.
Tabla: Comparación de características de levaduras en la elaboración de vino
| Característica | Saccharomyces cerevisiae | Torulaspora delbrueckii (convencional) | Levadura Torulaspora (de la invención) |
|---|---|---|---|
| Capacidad Killer | No (o K1, K2, K28, Klus) | No | Sí (contra todos los tipos de S. cerevisiae) |
| Degradación de ácido L-málico | Mínima | Baja/Nula | Alta (1-1.8 g/L) |
| Producción de ácido L-láctico | Mínima | Baja/Nula | Alta (>0.5 g/L) |
| Soporte a concentraciones de alcohol | Alta | Hasta 10º (baja viabilidad) | Hasta 14º (viva y activa) |
| dsRNA vírico (1-2 Kpb) | No especificado | No especificado | Sí |
| Patrón RFLP mitocondrial | Bandas de alto peso molecular | Diferenciable de S. cerevisiae | Diferenciable de S. cerevisiae (sin bandas de alto peso molecular) |
| Dominancia de fermentación | Dominante | No dominante (desplazada por S. cerevisiae) | Dominante hasta 1.000-1.005 g/L |
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