El agar de papa y dextrosa (APD), conocido por sus siglas en inglés como PDA (Potato Dextrose Agar), es un medio común de cultivo microbiológico utilizado para el aislamiento y recuento de hongos filamentosos y levaduras. Este medio nutritivo es de gran utilidad en diversas áreas, incluyendo el análisis de productos lácteos, bebidas embotelladas, alimentos, cosméticos, productos farmacéuticos y muestras ambientales.
Composición del Agar Papa Dextrosa
El medio PDA se prepara a partir de infusión de patata y dextrosa, combinando extracto de papa, dextrosa y agar-agar. La infusión de patata actúa como fuente de almidones, mientras que la dextrosa proporciona la base para el crecimiento de hongos y levaduras. La combinación de la infusión de papa con la glucosa proporciona la fuente de energía perfecta para un crecimiento satisfactorio de los hongos.
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO
Preparación del Agar Papa Dextrosa
La preparación correcta del Agar Papa Dextrosa según estándares internacionales y regulaciones es fundamental para obtener resultados confiables y reproducibles. El medio de cultivo Agar de Dextrosa y Papa es conocido como PDA por sus siglas en inglés. A continuación, se detalla el proceso de preparación:
Método con medio deshidratado comercial:
- Rehidratar 39 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada.
- Reposar de 10 a 15 minutos.
- Calentar agitando frecuentemente hasta el punto de ebullición durante 1 minuto para disolverlo por completo.
- Esterilizar en autoclave a 121ºC (15 lbs de presión) durante 15 minutos.
- Enfriar aproximadamente a 45ºC.
- Vaciar de acuerdo a la técnica a seguir en cajas de Petri estériles.
Cuando se requiera el medio inclinado en tubo, distribuirlo antes de esterilizar. En este caso, antes de esterilizar en el autoclave se colocan de 12 a 15 ml del medio en tubos, posteriormente se autoclavan y al salir se acuestan en soportes especiales hasta que solidifique. El pH de este medio queda en 5,6 ± 0,2.
Método a partir de patatas frescas:
- Se lavan muy bien las papas quitando la tierra que posean.
- Se cortan en rodajas finas con todo y piel. La infusión de patata se puede preparar hirviendo 200 g de patatas cortadas en rodajas sin pelar en aproximadamente 1 litro de agua destilada durante 1800 segundos.
- Luego se filtra el caldo a través de una gasa.
- Se añade agua destilada de manera que el volumen total de la suspensión sea 1 litro.
- Se añaden 20 g de dextrosa.
- Se añaden 15 g de agar en polvo.
- Esterilizar en autoclave a 121ºC durante 15 minutos.
- Dejar enfriar hasta 50 °C y servir en placas de Petri estériles.
El agar de patata y dextrosa puede ser suplementado con antibióticos o ácidos para inhibir el crecimiento bacteriano. El bajo pH (3.5) evita el crecimiento de las bacterias. Cuando se va a usar para el recuento de hongos y levaduras, agregar al medio de cultivo una vez esterilizado y enfriado aproximadamente a 45ºC, 14 ml de una solución estéril de ácido tartárico al 10% para obtener un pH aproximado de 3.5. Para mayor selectividad frente a bacterias en muestras ambientales o alimentos, se puede añadir ácido tartárico. El PDA es un medio de cultivo nutritivo que combina extracto de papa, dextrosa y agar-agar. El PDA fue desarrollado originalmente por Reddish en 1919 y estandarizado por la USP en 1950.
Aplicaciones del Agar Papa Dextrosa
El PDA es particularmente útil para el aislamiento de hongos fitopatógenos, es decir, que afectan a los vegetales. Este medio también se puede utilizar para determinar la carga de hongos y levaduras presentes en muestras vegetales, alimentos, cosméticos o fármacos.
Recuento de Hongos y Levaduras:
Para el recuento colonial, el medio es recomendado. El medio es recomendado para el recuento colonial, para promover el crecimiento de hongos y levaduras de importancia clínica. Verter 1 ml de la muestra -preferiblemente diluida- en una placa de Petri estéril y vacía, posteriormente fundir un taco de agar papa dextrosa y dejar enfriar a 45 °C. Verter sobre la placa de Petri y rotar hasta homogenizar. Sembrar el medio de cultivo por estría en la superficie o adicionar la muestra para la técnica de vaciado en placa. Incubar en aerobiosis a 20-25 °C (mohos) o a 30-32 °C (levaduras) por 5 a 7 días o más, dependiendo del tipo de hongo que se busca y el tipo de muestra. Incubar hasta 7 días a temperatura ambiente.
Toma de Muestras:
- La toma de muestra se debe hacer usando una hoja de bisturí Nº 11, bien sea para cortar cabello afectado, escamas de la piel o uñas en busca de dermatofitos.
- En lesiones exudativas, la muestra se toma con torunda seca o húmeda.
- Otro método de toma de muestra es a través de la técnica del cuadrado de moqueta de Mariat y Adán Campos.
- Dependiendo de la patología, puede cortarse la parte afectada o arrancados de raíz. Se pueden hacer raspados o cortar una parte específica de la uña afectada.
- En un vaso de 50 cc con alcohol al 50% colocar los trozos de las hojas (pedazos manchados y sanos), para desinfectar la superficie por 20 a 30 segundos. Tirar el hipoclorito de sodio y tomar con una pinza estéril los pedacitos desinfectados y colocarlos en la superficie del medio (un máximo de 10 pedazos).
Control de Calidad del Agar Papa Dextrosa
De cada lote preparado se debe tomar 1 o 2 placas e incubarlas a 25 °C por 48 horas o a 20 °C por 96 horas. El crecimiento control incluye cepas como Candida albicans (ATCC 10231) y Aspergillus brasiliensis (ATCC 16404). Otras cepas de control pueden ser Saccharomyces cerevisiae ATCC 9763 y Trichophyton mentagrophytes ATCC 9533.
Para la conservación de cepas de hongos, se cultiva el hongo en cuñas de agar papa dextrosa y una vez crecido el hongo, este se cubre con aceite mineral. El aceite debe ser esterilizado en autoclave por 45 minutos, y tener una viscosidad aproximada de 300 a 330 Saybolt.