El agar manitol extracto de levadura, comúnmente conocido como agar manitol salado, es un medio de cultivo altamente selectivo y diferencial que juega un papel primordial en el diagnóstico clínico de enfermedades y en la higiene alimentaria. Su formulación específica permite el aislamiento e identificación de microorganismos patógenos, especialmente estafilococos, lo que contribuye a la rapidez en la caracterización de un agente infeccioso y a la aplicación de una terapia adecuada al paciente.
Composición y Principio de Funcionamiento
Este medio selectivo, formulado por Chapman, contiene una alta concentración salina que inhibe a la mayoría de microorganismos, exceptuando algunos gérmenes halofílicos y a los estafilococos. La composición del agar manitol salado incluye el alcohol polihidroxílico (manitol) y el indicador de pH, rojo fenol.
El rojo fenol es de color rojo a pH 8,2 y cambia a amarillo a pH por debajo de 6,8. La producción de ácido a raíz de la fermentación del manitol cambia el pH del medio, causando un viraje de color del indicador Rojo de Fenol que pasa de rojo-rosa a amarillo. Por lo tanto, los estafilococos patógenos, la mayoría coagulasa positivos y que son fermentadores de manitol en su casi totalidad, crecen muy bien en este medio, produciendo colonias grandes, más o menos amarillentas rodeadas por un halo de viraje del medio de color amarillo.
Manitol Salado Agar
Aplicaciones del Agar Manitol Salado
El agar manitol salado es un medio altamente selectivo para el aislamiento primario de estafilococos patógenos, cuya composición incluye el alcohol polihidroxílico (manitol). Este sustrato permite la identificación de estafilococos coagulasa-positivos pertenecientes fundamentalmente a la especie Staphylococcus aureus, por su capacidad de fermentar el manitol, característica que ha sido considerada como un índice de patogenicidad. Staphylococcus aureus es considerado un patógeno bacteriano serio desde que desarrolló resistencia a la penicilina en 1950.
El agar manitol salado ha sido empleado también en estudios de resistencia a antibióticos, en los cuales ha demostrado una especificidad de 98,1 % y una sensibilidad de 95,1 % con cepas de Staphylococcus oxacilina resistentes. Es ampliamente utilizado en los protocolos de control higiénico de alimentos para la búsqueda de Salmonella spp.
Optimización y Mejoras en la Formulación
Para responder a las exigencias actuales del diagnóstico microbiológico y buscar mayor velocidad en la identificación, se han realizado modificaciones a la formulación original del medio agar manitol salado. Los nuevos microorganismos reconocidos como agentes patógenos exigen mayores requisitos respecto a la especificidad y sensibilidad de diagnóstico, por lo que se hace difícil lograr un producto para la caracterización rápida e identificación de estos.
Es esencial, por ello, el uso de medios de cultivo primarios adecuados y de respuesta rápida, para lograr así el aislamiento óptimo de los microorganismos. Las variables para la optimización de la formulación del medio fueron la composición de bases nutritivas y la concentración de colorante.
Estudios de Variantes Experimentales
Para realizar las diferentes variantes a escala experimental, se emplearon bases nutritivas obtenidas en BioCen (Cuba) e ingredientes de QueLab (Canadá) (D-manitol, cloruro de sodio, rojo fenol, agar), además del medio de referencia: agar manitol salado QueLab (lote: 23181743) y agar para conteo en placa QueLab (lote: 21071742). Se evaluaron 5 variantes experimentales:
| Ingredientes | V1 (g/L) | V2 (g/L) | V3 (g/L) | V4 (g/L) | V5 (g/L) |
|---|---|---|---|---|---|
| Peptona Z | 10,0 | 6,5 | 4,0 | 4,0 | 4,0 |
| Triptona | - | 6,5 | 4,0 | 4,0 | 4,0 |
| Extracto de levadura | - | 2,0 | 2,0 | 2,0 | 2,0 |
| Extracto de carne | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 | 1,0 |
| Peptona de sangre | - | - | 5,0 | - | - |
| Peptona pancreática de corazón I | - | - | - | 5,0 | - |
| Peptona pancreática de corazón II | - | - | - | - | 5,0 |
| Cloruro de sodio | 75,0 | 70,0 | 70,0 | 70,0 | 70,0 |
En la evaluación microbiológica de las variantes experimentales se usaron cepas certificadas de la American Type Culture Collection (Staphylococcus aureus ATCC 25923, Staphylococcus epidermidis ATCC 12228 y como control negativo Escherichia coli ATCC 25922) y, además, una cepa salvaje de Staphylococcus saprophyticus. Se analizó el crecimiento de los microorganismos en el tiempo midiendo la densidad óptica, por el método espectrofotométrico a 640 nm.
Resultados de la Optimización
Con la ayuda de las variantes experimentales se obtuvo el valor óptimo del indicador rojo fenol (0,0083 g/L). El análisis estadístico arrojó que la mejor variante fue la variante 4. La evaluación fisicoquímica, organoléptica y microbiológica realizada al nuevo producto resultó satisfactoria y confirmó el éxito obtenido en el desarrollo de la nueva variante. El diagnosticador modificado posee cualidades superiores, como rapidez en la visibilidad de las reacciones (cambio del color del medio a amarillo) de degradación del manitol a ácido y menor toxicidad para los microorganismos, pues el valor final del contenido del indicador de pH utilizado resultó ser 3 veces menor que el anteriormente utilizado en el agar manitol salado (BioCen, 8P1).
Además, el nuevo producto presenta un elevado contenido nutricional, con valores de nitrógeno amínico y total significativamente superiores. Igualmente, se observó que tanto el tamaño de las colonias como la formación del halo de fermentación a su alrededor fueron mayores en el agar manitol salado optimizado (9P1) en comparación con la formulación ya existente.
Conservación y Preparación
Es imprescindible la conservación de este medio de cultivo a 4 - 15 ºC, preferiblemente en la oscuridad. Para su preparación, se suspenden 62,5 g del polvo por litro de agua destilada. La superficie del medio debe aparecer húmeda, sin exceso de agua. Se llenan los tubos de ensayo hasta la tercera parte y se esterilizan a 121°C por 15 minutos.