El sector vitivinícola se enfrenta al reto de un mercado cada vez más exigente en el que los consumidores demandan vinos diferenciados de calidad, a lo que se une el hecho de su preocupación e interés por todo aquello relacionado con la salud y el medio ambiente.
La fermentación maloláctica (FML) es una de las dos fermentaciones principales en la elaboración del vino. El proceso convierte L-malato en L-lactato y dióxido de carbono, y puede llevarse a cabo por bacterias autóctonas de ácido láctico (LAB) presentes en el mosto y/o en la bodega, aunque la inducción de la fermentación maloláctica por inoculación de cepas comerciales se está convirtiendo en una práctica frecuente. Este proceso conduce a la desacidificación del vino, mejora su estabilidad microbiológica y, además, es responsable de numerosas transformaciones que mejoran las características organolépticas del mismo.
En este trabajo se ha estudiado la microbiota bacteriana natural en los mostos y vinos de la D.O.Ca. Rioja desde la obtención del mosto de uva hasta la finalización de la fermentación maloláctica (FML). Esta microbiota evolucionó desde unos valores medios de 104 UFC/ml en el mosto, a valores prácticamente indetectables en plena fermentación alcohólica (FOH), recuperándose de nuevo a finales de la FOH y en los momentos previos a la FML. Desde el mosto a las etapas previas a la FML se observó una gran diversidad de especies de los géneros Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc y Oenococcus, siendo Lactobacillus el género predominante y Oenococcus minoritario. Sin embargo, en las etapas previas a la FML se observó un incremento de O. oeni y durante el desarrollo de la FML esta especie fue dominante.
La FML espontánea es muy difícil de lograr y la inducción de la misma con estárteres comerciales no siempre tiene éxito al tratarse de un ambiente muy hostil para el desarrollo bacteriano. La posibilidad de contar con cultivos iniciadores autóctonos, adaptados a las condiciones de cada tipo de vino, sería muy interesante para la obtención de una FML exitosa, lo que requiere de estudios ecológicos de la diversidad bacteriana asociada a los diferentes procesos espontáneos.
El primer objetivo de esta investigación fue estudiar la diversidad bacteriana asociada a la fermentación maloláctica en vino Albariño de la región vitivinícola Val do Salnés (Galicia, España). De este aislamiento se obtuvieron 35 cepas de bacterias ácido lácticas que fueron identificadas por métodos bioquímicos, como la tinción Gram, la prueba de la catalasa o el test API50CHL, y moleculares, basados en el análisis de secuencias de ADN (ADN ribosómico 16S, región intergénica 16S-23S y gen recA) tanto mediante secuenciación como mediante el análisis de restricción con diversas enzimas (ARDRA). Al término de esta identificación, los aislados fueron agrupados en 4 géneros y 6 especies: Lactobacillus hilgardii, L. paracasei, L.
La capacidad de los 16 aislados que mostraron una mayor tasa de crecimiento, para conducir la fermentación maloláctica en las condiciones y características de los vinos de esta región, se evaluó en microfermentaciones. Ocho de las cepas estudiadas mostraron una capacidad notable para consumir ácido málico sin incrementar los niveles de ácido acético. Por otra parte, la capacidad para producir fenoles volátiles que pudieran afectar negativamente al aroma del vino fue descartada en las ocho cepas que mostraron actividad maloláctica. Por último, tanto las cepas seleccionadas de L. hilgardii como L.
Se ha obtenido asimismo una colección importante de cepas de bacterias lácticas (BL) autóctonas de los mostos y vinos de D.O.Ca. Rioja y se han puesto a punto métodos de la Biología Molecular para su identificación a nivel de especie y clonal. Se detectó una mayor reproducibilidad y mayor poder de discriminación con la técnica de electroforesis de campos pulsados (PFGE) y la enzima de restricción SfiI respecto a la técnica de amplificación al azar del DNA polimórfico (RAPD) para la discriminación clonal de los aislados de O. oeni y de L. plantarum de origen enológico.
Se ha llevado a cabo una FML inducida con BL obtenidas en este trabajo y se ha monitorizado correctamente el proceso para determinar el nivel de implantación mediante la técnica de PFGE. Por otro lado, se ha puesto a punto la técnica de electroforesis en gradiente de desnaturalización (DGGE) para el estudio directo de la microbiota bacteriana del vino sin cultivos previos. La técnica de DGGE utilizando dos parejas de cebadores diseñadas en este estudio, sirvieron para diferenciar especies de bacterias lácticas+acéticas, y bacterias lácticas del mosto y del vino, respectivamente. Asimismo, estas parejas de cebadores fueron útiles para la secuenciación e identificación a nivel de especie.
El objetivo de esta Tesis Doctoral ha sido profundizar en el conocimiento de la fermentación maloláctica de vinos tintos elaborados en Castilla-La Mancha, con el fin último de contribuir a la mejora de la calidad de los mismos. Los resultados obtenidos en esta Tesis Doctoral han sido recogidos en 9 publicaciones científicas y han permitido: 1) Conocer en profundidad la microbiota presente durante la fermentación maloláctica de los vinos de la D.O. 5) Demostrar la utilidad de la cepa autóctona O. oeni CECT 7621, especialmente cuando es utilizada en co-inoculación con las levaduras, como alternativa a la fermentación maloláctica tradicional en vino de las variedades Tempranillo, Merlot y Cabernet Franc.
En este estudio se examinó el impacto de la inoculación de cepas de Torulaspora delbrueckii (Td) en dos tipos de vinificaciones: vino rosado y vinos de maceración carbónica (MC), teniendo como objetivo mejorar el proceso fermentativo y las características de los vinos resultantes. La presencia de las cepas de Td en la MC aumentó el contenido de antocianos y modificó el perfil volátil, destacando un aumento de acetato de isoamilo. Las evaluaciones sensoriales mostraron aromas distintivos en los vinos de la cepa TdV. Con respecto a los vinos rosados, la inoculación secuencial de Td también influyó en la composición del color y la formación de antocianos. Respecto a la fermentación maloláctica (FML), se utilizaron estrategias de FML inoculadas y espontáneas. La sinergia entre Td y Oenococcus oeni aceleró la FML en algunos casos, principalmente en los vinos de MC.
La investigación tiene como objetivo principal estudiar tanto la viabilidad, como los efectos positivos y negativos producidos por el uso del polen de abeja en la vinificación en blanco y en tinto. La metodología de trabajo se ha desarrollado a escala laboratorio-piloto. En una primera fase se analizaron los efectos de diferentes dosis de polen, tanto en la vinificación en blanco como en tinto. Para cumplir con los objetivos marcados, se han llevado a cabo la vinificación en blanco de las variedades Palomino fino y Riesling, y la vinificación en tinto de la variedad Tintilla de Rota. La aplicación del polen fue realizada directamente sobre los mostos blancos desfangados o sobre la vendimia tinta despalillada y molturada antes de la fermentación alcohólica.
En primer lugar, se estudió si el polen en sus diferentes dosis tenía algún tipo de efecto sobre la composición fisicoquímica de los mostos blancos y tintos. Los resultados mostraron que la adición de polen conlleva a un aumento significativo de los niveles de nitrógeno fácilmente asimilable (NFA) en los mostos blancos y tintos, estableciéndose una correlación lineal con la dosis de polen. Asimismo, los resultados no mostraron cambios significativos en la densidad, salvo para las dosis más altas (10 y 20 g/L), donde posiblemente hay una cierta aportación de azúcar, tal como se había observado en estudios preliminares con hidromiel.
En segundo lugar, se llevó a cabo la fermentación alcohólica de los mostos blancos y el encubado de los tintos. Para el inicio de la fermentación se emplearon inóculos de levaduras secas activas (LSA) y una temperatura controlada de 19⁰C. Durante la fermentación alcohólica, se realizó un seguimiento de la densidad, del NFA, y la biomasa viable (levaduras). Los resultados de las medidas de densidad y de biomasa mostraron en todos los casos, que con la presencia de polen se mejoraba la cinética fermentativa y la capacidad de reproducción de las levaduras durante la fase exponencial de crecimiento. La evolución del NFA showed que el polen es capaz de mantener e incluso aumentar los niveles de NFA durante la fermentación, sobre todo a dosis altas, ya que actúa como fuente de reserva que se va liberando posiblemente gracias a la acción solubilizante del alcohol.
En tercer lugar, una vez finalizada la fermentación alcohólica, los vinos blancos se clarificaron y estabilizaron por frío antes de ser filtrados, para luego ser embotellados con presencia de atmósfera inerte (N2) antes de su caracterización físico-química y sensorial. Los resultados de la caracterización físico-química indicaron que el polen no afecta de manera significativa al contenido en etanol, acidez volátil y pH, incluso a las dosis más altas.
En el caso de los vinos tintos, terminada la fermentación alcohólica, se descubaron por decantación y se trasvasaron a recipientes limpios e inertes, para el desarrollo de la fermentación maloláctica. Para esta segunda fermentación, se utilizó un inóculo de bacterias ácido lácticas Oenoccous oeni (Laffort, Burdeos, Francia). La fermentación maloláctica se controló mediante la cuantificación del ácido málico. Los resultados mostraron un aumento de la velocidad de consumo de este sustrato con la dosis de polen, observándose así una influencia positiva del polen sobre las bacterias lácticas. Una vez finalizado el proceso, los vinos fueron decantados en frío y los vinos limpios se embotellaron con atmósfera inerte (N2) para evitar alteraciones hasta su caracterización fisicoquímica.
En cuarto lugar, mediante cromatografía de gases se analizaron y se caracterizaron los compuestos volátiles minoritarios (CG-GM) y mayoritarios (CG) de los vinos finales. Los resultados mostraron de forma general que la adición de polen produce un aumento en los compuestos volátiles totales, tanto en los vinos blancos como en los tintos, aunque los comportamientos de las familias de compuestos fueron algo diferentes en ambos tipos de vinos. En Palomino fino, los mayores incrementos se produjeron a las dosis altas de polen (10 y 20 g/L), mientras que en Riesling y Tintilla este efecto se produjo a dosis bajas (0,1, 0,25 g/L) fundamentalmente. En los vinos tintos, la producción de compuestos volátiles totales con el polen no fue tan importante posiblemente porque fueron atenuados por la presencia de los hollejos durante la fermentación alcohólica.
En quinto lugar, se realizó un análisis sensorial descriptivo de todos los vinos por parte de un panel de cata. Por un lado, se analizaron los atributos organolépticos generales (carácter frutal, floral, especiado, en nariz; dulzor, acidez, amargor, astringencia, salinidad, cuerpo y persistencia, en boca) y por otro, los atributos olfativos específicos para vinos blancos y los específicos para vinos tintos. Los resultados corroboraron lo observado en los VAO. Los vinos blancos y tintos elaborados con dosis bajas de polen mostraron los valores más altos en las notas a frutas y flores, siendo estos atributos los más influyentes en las notas de cata. Mientras que, con las dosis altas, en los vinos blancos se intensificaron los olores más vegetales, a cereal y a polen, y en los vinos tintos, las frutas se tornaron más maduras y/o pasificadas. Como resultado final se estableció que la dosis de polen que había producido una mejora en la calidad sensorial de los vinos blancos y tintos fue 0,25 g/L.
En sexto lugar, y con objeto de validar el polen frente a otros activadores comerciales, se volvieron a realizar las vinificaciones con las mismas variedades de uva (Palomino fino, Riesling y Tintilla de Rota), comparando el uso de la dosis seleccionada de polen de abeja frente a la misma dosis de un activador comercial (Laffort, Burdeos, Francia). Inicialmente se estudió el efecto sobre el NFA, y en ese sentido los resultados mostraron que tanto el polen como el activador comercial aumentaban en la misma proporción los niveles de NFA iniciales del mosto. En relación a la cinética fermentativa, en la mayoría de los casos, los vinos con polen experimentaron mejoras en comparación con el activador comercial y con los vinos testigo. De la misma forma, los vinos con polen fueron los que presentaron los mayores incrementos en las poblaciones de levaduras.
Con los vinos finales se trabajó de igual forma al estudio con diferentes dosis. Los vinos tintos descubados fueron inoculados usando un pie de cuba de bacterias lácticas comerciales y una vez se inició la fermentación maloláctica, su evolución fue controlada haciendo el seguimiento del contenido en ácido málico. En todos los casos, los resultados mostraron de nuevo que el polen ejerce una influencia positiva sobre la fermentación maloláctica, siendo estos vinos los que presentaron una velocidad de consumo de ácido málico ligeramente mayor, en comparación con el activador comercial y el testigo. Los resultados de la caracterización de los vinos finales, blancos y tintos, no indicaron en ningún caso alteraciones en los parámetros físico-químicos, salvo ligeras modificaciones no significativas en los parámetros del color.
En los vinos blancos de Palomino fino y Riesling con polen, se advirtió un comportamiento muy similar al de los experimentos con diferentes dosis de polen. De forma general, los mayores incrementos fueron observados en las familias de los alcoholes superiores, terpenos, ésteres y aldehídos, en los vinos con polen en comparación con los testigos. Mientras que, en los vinos tintos, las familias de compuestos con mayores incrementos fueron los alcoholes superiores, fenoles, terpenos, ésteres, tioles, norisoprenoides y lactonas. El estudio de los VAO mostró incrementos en las series odorantes con el uso del polen, frente al activador comercial, que presentó descensos en la mayoría de las series, sobre todo en las mayoritarias (afrutado, floral, grasa, herbáceo y frutos secos).
En séptimo lugar, los vinos obtenidos en los experimentos comparativos fueron analizados mediante el análisis sensorial descriptivo, además de aplicar la prueba triangular (ISO 4120:2007 AENOR, 2008) y el test de ordenación (ISO 8587:2006 AENOR, 2010). En este caso, no solo se obtuvo la información descriptiva de los vinos, sino que, mediante la aplicación de la prueba triangular, se pudo conocer si existían diferencias significativas entre los vinos elaborados con polen y con activador comercial. La evaluación de los atributos olfativos generales, mostró que tanto los vinos blancos como los tintos elaborados con polen, presentaron mayor intensidad en el carácter frutal y floral, en comparación con el activador comercial y el testigo. Al analizar los resultados de los atributos específicos, se observó que, en los vinos blancos, los incrementos en fruta eran debido a mayor proporción de aromas a frutas blancas, tropicales y cítricos, junto con un aumento en aromas a flores blancas. En los vinos tintos, los incrementos eran debido a mayor intensidad en frutas rojas, negras, tropicales y algo de frutas blancas, y en flores rojas y azules. Los resultados de las pruebas triangulares mostraron diferencias significativas entre todos los vinos de Riesling y los de Tintilla de Rota (control, polen y activador comercial), sin embargo, entre los vinos control y con polen de Palomino fino, no se encontraron diferencias. Por otro lado, el test de ordenación indicó que, de forma significativa en todos los casos, los vinos con polen fueron los preferidos por los catadores (“consumidores”). En el caso de Palomino fino, los vinos con mayor preferencia fueron, en igualdad de puntuaciones, los vinos con polen y los vinos con activador comercial.
En octavo lugar, durante el desarrollo de esta tesis doctoral, se ha realizado una estancia de investigación en el centro extranjero Institut des Sciences de la Vigne et du Vin (ISVV) de Burdeos (Francia), en la región de Aquitania, considerado como centro de referencia internacional en investigación en el campo de la enología. En el período de estancia, se efectuaron experimentos comparativos con polen de abeja y un activador comercial, utilizando las variedades tintas Cabernet sauvignon y Merlot. Debido a diferencias en la metodología utilizada en ambos centros de investigación, en el capítulo referente al estudio comparativo solo se han incluido los resultados de aquellos análisis realizados con metodología similar a los realizados en España.
El análisis de los mostos de ambas variedades no mostró alteraciones en los parámetros físico-químicos, salvo en el contenido inicial en NFA en los mostos con polen y activador comercial, al igual que se observó en los mostos de Tintilla de Rota. Durante el desarrollo de la fermentación alcohólica, el comportamiento de la cinética fermentativa fue muy parecido en Cabernet sauvignon y Merlot, salvo antes de alcanzar la recta final, donde se observaron diferencias significativas entre el polen y el testigo en Cabernet, y entre el polen y el activador comercial junto con el testigo en Merlot.
Una vez finalizada la fermentación alcohólica, se siguió la misma metodología que en Tintilla de Rota, se inoculó un pie de cuba de bacterias ácido lácticas comerciales y se controló la evolución de la fermentación maloláctica mediante el seguimiento de los niveles de ácido málico. En ambos casos se observó un comportamiento similar, tanto el testigo como el polen de abeja, presentaron los descensos de ácido málico más acusados que el activador, causado posiblemente por algún problema de adaptación del inóculo al medio. Sin embargo, en la fermentación maloláctica, el perfil de consumo fue muy parecido en todos los vinos. Cuando terminó el proceso, los vinos limpios fueron embotellados con atmósfera inerte (N2) y conservados en refrigeración hasta su caracterización físico-química y su análisis sensorial.
Al igual que en los vinos de Tintilla de Rota, los resultados de los físico-químicos de los vinos, no mostraron diferencias elevadas entre ellos, salvo algunas en la acidez volátil y el contenido en azúcares residuales. Respecto a los parámetros de color, los vinos mostraron ligeros cambios en la componente b* con respecto a los vinos elaborados con polen. Mientras que en Cabernet sauvignon se incrementó levemente la componente amarilla, en Merlot los vinos presentaron más componente azul, cambios prácticamente imperceptibles desde una perspectiva visual.
Los resultados del análisis sensorial descriptivo de los vinos mostraron, al igual que en los vinos de Tintilla de Rota, que los atributos mejor puntuados en todos los casos fueron el carácter frutal y floral de los vinos con polen, en comparación con el activador comercial y testigo. El comportamiento en boca fue un poco diferente en ambas variedades. Los vinos de Cabernet con polen y control presentaron mayor amargor, que los vinos con activador comercial. En Merlot, los vinos con mayor intensidad de amargor fueron los vinos testigo y los elaborados con el activador comercial. Los resultados obtenidos de las pruebas triangulares mostraron que los vinos elaborados con polen y con el activador comercial presentaron perfiles sensoriales diferentes en comparación con el testigo. Sin embargo, al enfrentar los vinos con polen y con activador comercial, no se obtuvieron diferencias significativas entre los vinos. Esto puede indicar, que, a pesar de las diferencias sensoriales encontradas, existen pequeños matices en las notas de cata que pueden ser los responsables de marcar la diferencia entre los vinos.
Los resultados del test de ordenación, indicaron que los vinos de Cabernet elaborados con polen fueron preferidos de forma significativa, frente al activador y a los vinos testigo. Mientras que, en los vinos de Merlot a pesar de ser los vinos con polen de abeja los más puntuados por los catadores, no se observaron diferencias significativas.
Como conclusión, se puede indicar que el uso de polen incrementa los niveles de NFA en los mostos de uva, tanto blanca como tinta. Del mismo modo, su uso favorece la cinética fermentativa y consigue aumentar la biomasa viable durante el desarrollo de la fermentación.
(35) QUÉ ES LA FERMENTACIÓN MALOLÁCTICA?
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