Conservación de Levaduras Cerveceras: Técnicas y Buenas Prácticas

Desde tiempos remotos, los microorganismos han sido herramientas esenciales para la humanidad en la obtención de medicamentos y la elaboración de alimentos. En la industria de las bebidas alcohólicas, las levaduras han permitido desarrollar una inmensa gama de productos como vinos, cervezas, hidromieles, sidras, sake, whisky, gin, y vodka. El uso creciente de microorganismos en esta industria ha resaltado la necesidad de mantenerlos en forma pura y viable, asegurando que sus características importantes permanezcan inalterables en el tiempo.

Métodos de Preservación de Levaduras

Los métodos de preservación de levaduras se clasifican en aquellos que mantienen el microorganismo metabólicamente inactivo y aquellos que lo mantienen metabólicamente activo.

Preservación Metabólicamente Inactiva

En el primer caso, la criopreservación y la liofilización son los métodos más utilizados para la preservación de levaduras.

• Liofilización: Se basa en la sublimación del agua en estado sólido a muy baja presión, utilizando un liofilizador. El microorganismo se convierte en polvo seco y puede almacenarse por períodos prolongados.
• Criopreservación: Requiere congeladores que alcancen temperaturas entre -80 °C y -150 °C. Un segundo método es el uso de nitrógeno líquido, que permite temperaturas inferiores a -190 °C, aunque requiere un tanque y suministro periódico de nitrógeno. Para una preservación a largo plazo, se recomiendan temperaturas inferiores a -150 °C. Las temperaturas entre 4 °C y -20 °C, como las de un refrigerador doméstico, solo son útiles para períodos muy cortos (algunas semanas).

Las ventajas de estos métodos incluyen largos períodos de preservación con actividad metabólica microbiana inactiva, cambios genéticos casi nulos y menor riesgo de contaminación. Sin embargo, requieren equipamiento sofisticado, personal capacitado y varios pasos para la regeneración de un cultivo viable.

Preservación Metabólicamente Activa

Normalmente, en las fábricas de cerveza sin protocolos de preservación a largo plazo, se realiza la transferencia periódica de cultivos a un medio fresco para mantener su viabilidad. Este método, aunque simple y sin equipamiento especializado, presenta un alto riesgo de contaminación y posibles cambios genéticos/bioquímicos no deseados, afectando la reproducibilidad del producto. Si las levaduras se mantienen a 4 °C, los traspasos a medios nuevos son obligatorios, lo que puede generar diferencias en el producto fermentado debido a adaptaciones genéticas o contaminación.

Almacenamiento de Levaduras en Agua Destilada

La técnica para almacenar levaduras en agua destilada es muy simple y efectiva. Permite almacenar cultivos de forma estable por períodos de tiempo prolongados, siendo económica y sin mayores dificultades que otros métodos. Los cultivos pueden mantenerse a temperatura ambiente y ocupan muy poco espacio. En experiencia, este método no ha causado pérdidas de viabilidad.

Procedimiento para el Almacenamiento en Agua Destilada

1. Cultivo Fresco y Libre de Contaminantes: Necesitará un tubo con Agar en plano inclinado o una placa de Petri con levadura. El cultivo debe ser fresco y libre de contaminantes. Si tiene más de un mes, es buena idea inocular otro tubo para verificar su viabilidad.
2. Preparación de Tubos: Llene los tubos a un tercio (cerca de 2 mL) con agua destilada y coloque la tapa enroscándola algo floja para que el vapor pueda entrar y salir libremente.
3. Esterilización: Una vez preparados los tubos estériles y un área de trabajo estéril, utilice un lazo de inoculación estéril para recoger levaduras y transferirlas al tubo de agua destilada estéril. Cierre la tapa firmemente y séllela con cinta aislante eléctrica para asegurar que esté sellada respecto del medio ambiente. Sacuda el tubo firmemente para diluir los terrones de levadura.
4. Almacenamiento: Guarde los tubos con el cultivo preservado lejos de la luz diurna y en un área alejada de fluctuaciones térmicas. Se pueden refrigerar, pero no es necesario.

Para reducir la probabilidad de perder un cultivo, se recomienda hacer tres tubos de cada cultivo y usarlo exclusivamente hasta que se contamine. Descarte el primer tubo, verifique el segundo y, si está bien, úselo para hacer un cuarto tubo.

Uso de Criotubos y Glicerina

Este método es más sencillo y rápido, aunque los criotubos deben conservarse en el congelador. Los criotubos son mucho más pequeños y se llenan con glicerina hasta la mitad, ya que la glicerina impide que la levadura se congele. Una vez esterilizados los criotubos con glicerina en una olla a presión y enfriados, se procede al llenado con levadura. Utilice una jeringa esterilizada y un mechero de alcohol para evitar contaminaciones. Llene los criotubos, ciérrelos bien, mézclelos con unos meneos y guárdelos en el congelador.

Reutilización de Levaduras en Cervecería

El poder reutilizar levaduras de la fermentación de cerveza es una gran ventaja. A nivel industrial, se requiere asegurar una nutrición adecuada, seguir estrictos protocolos de limpieza y desinfección, y seleccionar metodologías correctas de mantención de microorganismos para evitar pérdidas de producción por mala calidad, fermentaciones detenidas o contaminaciones.

Parámetros Clave para la Reutilización

Para la elección de un método de mantención, se debe tener especial cuidado en los parámetros de viabilidad, pureza y estabilidad de las propiedades de la célula. Si el objetivo es mantener los microorganismos para su reutilización, se recomienda fijar un número determinado de reutilizaciones (3, 4, 8 o 10), dependiendo de la técnica empleada y las medidas de seguridad. Una vez superado este límite, se aconseja adquirir una generación fresca de levadura de un proveedor para asegurar mayor viabilidad y pureza.

Buenas Prácticas de Manufactura (BPM)

El establecimiento de BPM es fundamental para delinear prácticas de trabajo seguro y reducir riesgos biológicos, accidentes de trabajo y contaminaciones del proceso productivo. Esto se logra estandarizando procesos y normas de bioseguridad.

Higiene

Es indispensable mantener un alto nivel de higiene, limpiando y desinfectando todos los sectores de elaboración. Los operarios deben estar capacitados en BPM, microbiología y seguridad biológica.

Inoculación

Al inocular microorganismos en una nueva fermentación, se deben considerar los siguientes puntos:

• Instrumentos de trabajo previamente limpios y desinfectados.
• Trabajar bajo un sistema cerrado de inyección/inoculación.
• Si el pitching rate es adecuado, se pueden inocular los microorganismos en un rango de temperatura no más allá de 4 ºC de la diferencia de temperatura de fermentación.
• Dejar la válvula de salida de CO2 sumergida en ácido peracético concentrado.

Mantención de Microorganismos

Una vez validados los procedimientos de limpieza, desinfección e inoculación, se puede iniciar un plan de mantención y reutilización. Los parámetros más importantes a considerar son:

• Nutrir al microorganismo al inicio de la fermentación.
• Realizar despiches periódicos durante el proceso fermentativo.
• Tener disponibilidad para bajar la temperatura del fermentador y producir la decantación y/o incorporación de CO2.

Los protocolos deben adaptarse según las recetas y la duración de la mantención, asegurando un adecuado sistema de frío para mantener la temperatura cercana a cero.

Recuperación de Levaduras

Las levaduras deben cosecharse en un sistema cerrado, evitando el contacto con el oxígeno, y mantenerse a una temperatura cercana a los 2 ºC.

Control de Calidad de la Levadura

Lo más importante para una reutilización es la calidad de la levadura, que implica que el inóculo esté libre de contaminantes y en óptimas condiciones fisiológicas para una fermentación limpia y con el perfil deseado.

Evaluación de Contaminantes

Es fundamental asegurar que los protocolos de limpieza y sanitización sean efectivos, ya que cualquier mínima contaminación se potenciará en sucesivas reutilizaciones. Aunque las técnicas de detección de contaminantes suelen requerir inversión y personal especializado, hay herramientas accesibles:

• Evaluación Sensorial: Es una de las herramientas más poderosas. Permite detectar características anómalas en la cerveza (ej. fenoles) que pueden indicar levaduras salvajes. Requiere entrenamiento y el hábito de probar el producto constantemente.
• Test de Mosto Forzado: Técnica sencilla y barata para evaluar la limpieza de los protocolos. Se recolectan muestras de diferentes puntos de la fábrica antes de inocular la levadura, se cultivan a 30°C y se observan cada 24 horas en busca de turbidez o producción de gas, indicando presencia microbiana.

Cuando se esté seguro de la ausencia de contaminantes, se puede enfocar en la levadura. Si se tienen recursos, es recomendable realizar análisis de contaminantes con laboratorios especializados periódicamente.

Comportamiento Fermentativo

Conocer el comportamiento fermentativo de la cepa de levadura es fundamental. La cinética de fermentación es un parámetro fácil de medir. Registrar la variación de la densidad en función del tiempo (curva de fermentación) permite comparar fermentaciones y detectar problemas. Cada cepa y fábrica tiene características únicas que influyen en este comportamiento.

Curva de Fermentación: Consiste en graficar la densidad vs. tiempo. Se mide la densidad inicial y luego periódicamente. Es importante definir una curva patrón para cada cepa y compararla con las fermentaciones en proceso. Una desviación importante puede indicar un estado fisiológico no óptimo de la levadura, lo que sugiere evitar su reutilización.

Sedimentación y Cosecha

La sedimentación en el tanque es determinante para la cosecha. Depende de la floculación de la cepa, el volumen de fermentación, el mosto y la geometría del fermentador. La floculación es la capacidad de las células de levadura de unirse formando agregados, influenciada por la cepa y la presencia de calcio.

Ventana de Cosecha: Debe definirse por la sedimentación y la resistencia en el cono de la cepa. Es crucial cosechar en el punto justo para priorizar la calidad de la levadura, minimizando la cantidad de cerveza.

El cono del fermentador se divide en tres partes para la reutilización:

• Parte Inferior: Compuesta por células muertas, células súper floculantes (poco atenuativas), restos de lúpulo y trub. No es indicada para reutilizar y debe descartarse.
• Parte Media: Contiene células vivas de comportamiento medio, ideales para la próxima fermentación.
• Parte Superior: Compuesta por levaduras de baja floculación, que tampoco se quieren para la reutilización.

Para acceder a la fracción deseada, se debe purgar el tanque. La estrategia de purgas es particular para cada fábrica y cepa. Observe los cambios de textura y olor de la crema de levadura para detectar problemas de contaminantes o estrés.

Reducción del Estrés en Levaduras

Para una buena calidad de levadura, es fundamental ajustar las condiciones de fermentación para disminuir el estrés de la levadura. El control de la temperatura es crucial, ya que las fluctuaciones impactan negativamente. Los nutrientes también son esenciales:

• Zinc: Cofactor de la enzima alcohol deshidrogenasa, indispensable para la producción de alcohol. Se necesita en una concentración de 0.15 - 0.3 ppm (máximo 1 ppm, ya que en alta concentración es tóxico).
• Oxígeno: Requerimiento esencial para la reutilización, se necesita en una concentración de 8-10 ppm. Se implementa con un tubo de oxígeno, un regulador y una piedra difusora a la salida del enfriador.

Determinación de la Vitalidad de la Levadura

Al reutilizar levaduras, no solo es necesario prestar atención al número de células vivas (viabilidad), sino también a su eficiencia (vitalidad).

• Acidification Power Test (AP TEST): Método reconocido pero laborioso, requiere mucho tiempo e instrumental específico y personal capacitado.
• Método CDR BeerLab®: Desarrollado para determinar la vitalidad sin necesidad de calibración ni personal especializado. Los reactivos vienen preenvasados y listos para usar.

Servicios de Preservación de Levaduras

En el ámbito de la preservación de levaduras, existen instituciones especializadas. La Colección Chilena de Recursos Genéticos Microbianos (CChRGM) del Instituto de Investigaciones Agropecuarias en Chillán se dedica a la preservación de microorganismos a largo plazo por métodos de liofilización y criopreservación. Ofrecen servicios de depósito privado y privado para fines de patentamiento, garantizando la confidencialidad de la información y el acceso exclusivo al depositante. La CChRGM posee la categoría de Autoridad Internacional de Depósito (IDA), otorgada por la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual (OMPI), siendo la primera en América Latina.

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