La fijación de levaduras al portaobjetos es un paso crucial para su observación microscópica, permitiendo mantener la integridad de la muestra y facilitar su tinción. A continuación, se detallan los procedimientos para fijar levaduras, tanto a partir de cultivos líquidos como sólidos, así como técnicas avanzadas para el estudio de su crecimiento.
Preparación de la muestra y fijación básica
A partir de cultivos en medio líquido
Si se parte de un cultivo en medio líquido, se carga el asa bacteriológica con una gota de cultivo y se deposita en un portaobjetos limpio. Se realiza una extensión de la muestra hasta conseguir una capa fina, conocida como frotis.
A partir de cultivos en medio sólido
Cuando se trabaja con un cultivo en medio sólido, primeramente se dispone una pequeña gota de agua en el portaobjetos. A continuación, se carga el asa con una pequeña cantidad de bacterias de una colonia del cultivo y se resuspende en la gota de agua, tras lo cual se procede a realizar el frotis.
Secado y fijación por calor
Posteriormente, se debe secar la preparación acercándola a la llama del mechero, evitando que se caliente demasiado. Para comprobar la temperatura, se puede tocar el portaobjetos con el dorso de la mano para asegurar que no queme. Una vez seca, se procede a la fijación haciendo pasar la preparación 3-4 veces por la llama del mechero, de manera que la llama toque la parte inferior del portaobjetos. A partir de este momento, la preparación está lista para teñir, y el procedimiento a seguir dependerá del tipo de tinción seleccionada.
Observación de levaduras con Carolina de la Rosa y Mia Salcines, alumnas del IES Marismas.
Técnicas avanzadas para el cultivo y fijación de levaduras en portaobjetos
Para estudios más detallados del crecimiento de las levaduras, se pueden emplear técnicas que implican el uso de placas de Petri modificadas y medios de cultivo específicos.
Se coloca un trozo de papel de filtro redondo en la parte inferior de la placa de Petri, se dispone una varilla de vidrio en forma de U sobre él y se colocan dos portaobjetos de vidrio sobre la varilla. Después de la esterilización, se agregan algunos mililitros de solución esterilizada al 20% permeable al aceite al papel de filtro de manera aséptica, cuya función principal es mantener húmedo el papel de filtro durante el proceso de cultivo.
Utilizando una pipeta Pasteur, se agrega agar de extracto de levadura derretido o agar papa dextrosa a la superficie del portaobjetos de vidrio para formar una capa delgada de medio de agar. Con un asa de inoculación, se siembra la levadura a ensayar en el portaobjetos de vidrio, se cubre parte del medio de cultivo con un cubreobjetos estéril, se tapa la placa de Petri y se incuba a 25 °C durante más de 7 días.
Se utiliza un microscopio de contraste de fase para observar el crecimiento de las bacterias en la fase de crecimiento y comparar el crecimiento de las bacterias expuestas al aire y debajo del cubreobjetos. También se puede quitar suavemente el cubreobjetos del portaobjetos de vidrio, dejar caer una gota de lactofenol, ácido lactofenol-pícrico o azul de algodón lactofenol para fijar las bacterias y luego cubrir el vidrio de la cubierta con parafina, esmalte de uñas o sellos adhesivos especiales.
Preparación simple para la observación de hifas
Para la observación de hifas, un procedimiento más simple puede ser el siguiente:
- Limpiar el portaobjetos y el cubreobjetos.
- Poner una gota de agua en el centro del portaobjetos de vidrio.
- Utilizar una aguja de disección para recoger algunas hifas.
- Aplicar sobre gotas de agua clara.
- Cubrir con un cubreobjetos.
Es necesario teñir para una mejor visualización, aunque también se puede observar sin teñir.
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